干细胞检定项目

发布时间:2021-09-10

人源特定病毒检测采用ELISA法和实时定量PCR法检测HIV、HBV、HCV、EBV、CMV、HTLV等人源特定病毒的表达。

    猪源病毒检测采用ELISA法检测胰酶中猪细小病毒。

    内毒素检测按《中华人民共和国药典》2010年版三部附录XIIE细菌内毒素检查法中的

    方法1凝胶法进行。

    细胞形态及活性通过光学倒置显微镜观察细胞形态;通过台盼蓝染色确定细胞数及细胞活率。

    染色体核型分析参考文献的方法,取传代后第3~4天处于增殖指数期的胞(P3代),更换新鲜培养液。加入20μg/ml秋水仙素125μl,作用4h。吸去含秋水仙素的培养液,加入胰酶消化细胞,细胞沉淀用低渗液处理5min,然后加入固定液固定细胞。进行G带染色,显微镜观察。

    UC-MSCs免疫表型检测通过流式细胞仪测定UC-MSCs表面CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR的表达情况。

    STR图谱分析提取UC-MSCs基因组DNA,质量鉴定后进行STR位点分析,位点包括9个(D13S317、TH01、D5S818、D16S539、Amelogenin、TPOX、D7S820、CSF1PO、vWA);使用荧光标记的特异扩增引物分别对9个人源STR位点进行PCR扩增,将不同荧光标记的PCR产物进行稀释并混合后,进行毛细管电泳检测,对毛细管电泳检测结果进行分析,判断细胞是否存在其他人源细胞污染。

    1.2.11UC-MSCs分化能力检测⑴成骨诱导分化:配制成骨诱导培养液——10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10nmol/L地塞米松,50mg/L维生素C;P3代细胞以2×103个/cm2的浓度接种于6孔板中,等细胞生长至80%融合后,更换为成骨诱导培养液,每2天换液1次,于诱导1、2、3周后,进行茜素红染色。去培养基,PBS洗2次;70%乙醇固定,4℃,1h;双蒸水洗2次;40mmol/L茜素红溶液(pH4.2)室温染色1~10min;镜下观察,照相。

    成脂诱导分化:除常规细胞培养的基础培养基外,加0.5mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤、60μmol/L吲哚美辛、0.5μmol/L氢化可的松和10μg/L胰岛素。细胞在此种培养基诱导4周后检测。去培养基,用PBS洗2次;甲醛-钙室温固定15min;PBS洗2次;60%异丙醇媒染1min;去异丙醇,油红O工作液室温染色30min;60%异丙醇浸洗1次;PBS洗2次;镜下观察,照相。

    异常免疫学反应分别采用1.0×104、5.0×104、2.5×105和5.0×105不同细胞量的UC-MSCs,照射后与5.0×104异体外周血CD3+T淋巴细胞(PBLCs)共培养,用终浓度为0.5μg/ml的PHA刺激其增殖,通过CCK-8法检测UC-MSCs对异体T淋巴细胞增殖能力的影响。

制备方法:新鲜脐带去羊膜及血管,剪碎,组织块放入无菌培养皿,在培养箱进行脐带间充质干细胞培养、扩增。细胞培养至P3代,按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》进行干细胞质量的全面检定。检定内容包括无菌检测,支原体检测,人源特定病毒及猪源病毒检测,内毒素检测,细胞形态、细胞数及细胞活率检测,染色体核型分析,干细胞免疫表型检测,STR图谱分析,免疫抑制活性检测及分化能力检测。

1、材料与方法

1、1材料

试剂  硫乙醇酸盐、改良马丁培养基、支原体半流体培养基及肺炎支原体;集菌器;鲎试剂及检查用水;内毒素工作标准品;梅毒螺旋体(TP)抗体诊断试剂盒、丙型肝炎病毒(HCV)抗体诊断试剂盒、乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原诊断试剂盒、人免疫缺陷病毒(HIV)抗体诊断试剂盒;巨细胞病毒IgM抗体(CMV)检测试剂盒;鼻咽癌病毒(EBV)核酸测定试剂盒和肺炎支原体(MP)核酸测定试剂盒;猪细小病毒检测试剂盒;HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、MP、TP荧光定量PCR试剂盒;CD90-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE、CD34-FITC、CD45-PE、IgG2a-PE、IgM-FITC抗体;基因组DNA提取试剂盒;荧光标记的特异扩增引物;CCK8试剂盒;间充质干细胞无血清培养基。

仪器  FACSCalibur流式细胞仪;ST16R离心机、多功能酶标仪、CO2气体培养箱;荧光定量PCR仪;全自动微生物培养检测系统;IX51荧光显微镜和光学倒置显微镜;生化培养箱。

方法

UC-MSCs 的制备 参考文献方法并进行优化。将新鲜脐带放入大培养皿中,去除羊膜及血管。将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm 3大小的组织块,取适量放入无菌培养皿中,覆盖70%培养皿的底面积。加入无血清培养基,左右振摇1min,使组织块分散均匀。放入5%CO237℃培养箱中培养。第5天半量更换培养基,继续培养10d左右,有长梭形细胞从组织块边缘长出;14d左右待细胞团长至约50%时倒掉组织块,同时收集细胞传代培养。每3天更换一次培养液,并用倒置显微镜观察细胞生长变化,待贴壁细胞长到瓶底的90%时进行消化传代,加入0.05%胰酶消化,按1:5的比例进行传代,在传代的同时使细胞进一步分离纯化。传至第3代时用不含血清的DMEM培养基配成活细胞密度为5×106个/ml的细胞悬液,用于下述各项检测。

无菌检测  按《中华人民共和国药典》2010年版三部附录 XII A无菌检查法进行;利用全自动微生物培养检测系统;取样品分别加入至需氧培养瓶(BPA)、厌氧培养瓶(BPN)中。将BPA和BPN置入全自动微生物培养检测系统,37℃培养7d。

支原体检测 按《中华人民共和国药典》2010年版三部附录 XII B细菌内毒素检查法中的方法:

结果

细胞形态及活性 根据标准化的 UC-MSCs 细胞分离、纯化、培养和扩增的操作流程,分离了 18 根脐带,获得了一致性及活性较好的细胞。细胞呈长梭形旋涡状排列; 台盼蓝染色结果显示细胞活率 ≥ 90%,冻存后细胞活率 ≥ 80%。

无菌试验  依据《中国药典》无菌试验检测规程及全自动微生物培养检测系统,两者的检测结果一致且特异性好。但是,利用薄膜过滤法检测到阳性样品的时间较全自动微生物培养检测系统要长,前者需要14 d,而后者仅需 7 d。因此,在实际操作中可同时进行此两种检测,以便较早发现潜在污染。

支原体检测  依据《中国药典》支原体检测规程进行,方法的可重复性很好,不同时间对同一标本进行检测,结果一致;同时利用荧光定量。

支原体检测依据《中国药典》支原体检测规程进行,方法的可重复性很好,不同时间对同一标本进行检测,结果一致;同时利用荧光定量 PCR 的方法进行支原体检测,结果表明该方法灵敏、省时,检测结果与药典检测规程结果一致。

细胞内外源致病因子的检测 结合 ELISA 和实时定量 PCR 的方法,对人源特定病毒包括 HIV、 HBV、 HCV、 EBV、 CMV、HTLV 和 TP 进行检测。检测结果显示两种方法的一致性较好,均较灵敏、特异;因细胞传代培养过程中要使用胰酶,因此,我们还利用 ELISA 的方法检测了猪源细小病毒,结果显示病毒为阴性。

内毒素检测结果 通过凝胶法检测细胞培养上清中内毒素含量≤ 5 EU/ml。

UC-MSCs 免疫表型检测 流式细胞仪检测细胞免疫表型,结果表明,CD90 和 CD105 表达阳性, 阳性率 > 95%, CD34、CD45、 HLA-DR 表达阴性,阳性率 < 2%。

染色体核型分析 通过染色体核型分析可以将染色体数目异常或有插入和缺失突变的个体排除,分析结果表明绝大多数细胞染色体核型正常,为 46 XY 或 46 XX2.8 STR 图谱分析分析结果表明样品来源单。

不含有其他人源细胞的污染。

 UC-MSCs 的分化能力UC-MSCs 细胞经成骨诱导后,茜素红染色阳性;经成脂诱导后,油红 O 染色可见明显的脂肪滴形成。结果显示 UC-MSCs 具有成骨和成脂等多向分化潜能。

异常免疫学反应 异体来源 UC-MSCs 制剂对人 T 淋巴细胞增殖具有抑制作用。这种抑制作用依赖于干细胞的存在,即 UC-MSCs 与 PBLCs 的剂量比为 0.2:1、1:1、5:1 和 10:1 均具有抑制作用,且抑制作用与干细胞数量呈正相关。

联系客服

客服专线

18853119859

微信扫码